AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS NA QUANTIFICAÇÃO, DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE PESTICIDAS

Aprovado em XX de mês COMISSÃO EXAMINADORA ________________________________________________ Prof. Dr. Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão Oswaldo Cruz - Cidade Orientador ________________________________________ XXXXXXXXX Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão Oswaldo Cruz ________________________________________ XXXXXXXXXXX Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão Oswaldo Cruz Dedicamos este trabalho primeiramente a Deus, segundo aos familiares pelo apoio no decorrer do curso, e terceiro ao corpo docente de professores pela paciência e o comprometimento durante todo o curso. AGRADECIMENTOS Dedico este trabalho primeiramente a Deus e em segundo a minha família, que me deu suporte em todos os desafios na minha vida pessoal e também na minha vida universitária ao longo desse curso. Tenho e sempre terei minha família como base, norte e fonte de sabedoria.

Figura 08 – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Figura 09 – Exemplo de cromatografia líquida. LISTA DE TABELAS Tabela 01 – Classificação dos pesticidas de acordo com suas estruturas químicas (continua). Tabela 02 – Classes toxicológicas dos pesticidas tendo como base a DL 50 por via oral. LISTA DE SIGLAS E ABREVEATURAS Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA Dessorção / ionização de laser assistida por matriz - MALDI Ingestão Diária Aceitável - IDA Ingrediente ativo - IA Ministério do Meio Ambiente pelo - MMA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA Organização Mundial da Saúde - OMS Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos - PARA SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 13 1. Organofosforados 26 3. Carbamatos 27 3. Toxicidade 27 3. Riscos de contaminação 28 4 ESPECTROMETRIA DE MASSAS 29 4.

Princípios de espectrômetro de massa 31 4. Utilização da cromatografia com detecção por espectrometria de massas acoplada à espectrometria de massas na determinação de substâncias tóxicas em alimentos 37 5. Parâmetros analíticos 39 CONSIDERAÇÕES FINAIS 40 REFERÊNCIAS 42 RESUMO Com o aumento da produção agrícola devido ao modelo convencional, provocou um grande impacto em relação ao uso de pesticidas em razão da degradação das pragas, o presente artigo tem como objetivo analisar a eficiência da espectrometria de massas na quantificação, detecção e identificação de pesticidas, analisando suas técnicas de aplicação sobre a análise dos pesticidas, e analisar quais os métodos mais eficazes e com maior grau de confiança. O estudo foi realizado por meio de uma revisão bibliográfica e artigos já publicados com diferentes abordagens referentes ao referido tema.

Ao final do estudo conclui-se através desse estudo a relevância das técnicas de análise de pesticidas visto que esses compostos são utilizados na produção de alimentos no Brasil e nos outros países, e os avanços das técnicas utilizadas no decorrer dos anos. Palavras-chave: Espectrometria de massas. Essas intoxicações podem ser agudas e crônicas nos seres humanos, na fase crônica podem acarretar em doenças graves como o câncer, doenças neurológicas, entre outras, em relação à intoxicação na fase aguda os sintomas são dores de cabeça, náuseas e fraqueza sendo predominante nos trabalhadores rurais, apesar das evidências científicas em relação à saúde, a maioria dos estudos são realizadas em animais in vitro expostos a um só agrotóxico, o que não ocorre no consumo diário dos alimentos das pessoas, visto que pode conter mais de um componente em apenas um alimento, sendo pouco provados os efeitos a exposição de pequenas doses.

A espectrometria de massas é uma das técnicas frequentemente aplicada para quantificar e detectar compostos químicos por meio de suas massas e estrutura química, com o objetivo de determinar as informações do peso molecular. Diante deste contexto o objetivo do presente trabalho é analisar a eficiência da espectrometria de massas na quantificação, detecção e identificação de pesticidas através de uma revisão bibliográfica, analisando suas técnicas de aplicação sobre a análise dos pesticidas, e analisar quais os métodos mais eficazes e com maior grau de confiança. A relevância desse trabalho se encontra na escassez em relação a estudos de resíduos de agrotóxicos/pesticidas em alimentos, diante desse cenário tendo poucos resultados divulgados em relação às análises feitas, portanto poucas evidências científicas, a metodologia utilizada foi por meio de uma revisão bibliográfica e artigos já publicados com diferentes abordagens referentes ao referido tema.

Justificativa A utilização de grandes quantidades de pesticidas para combater os danos às agriculturas promovem contaminação do meio ambiente e danos à saúde humana. Metodologia Segundo Gil (2000), o método científico pode ser entendido como o caminho para se chegar à verdade em ciência ou como o conjunto de procedimentos que ordenam o pensamento e esclarecem acerca dos meios adequados para se chegar ao conhecimento. Para a realização deste estudo, em primeiro lugar foi definido o tipo de pesquisa, desse modo, foi utilizado a metodologia de pesquisa bibliográfica. Como ressalta Severino (2007, p. “a pesquisa bibliográfica é aquela que se realiza a parti do registro disponível, decorrente de pesquisas anteriores, em documentos impressos, como livros, artigos, teses, etc”. A respeito da pesquisa bibliográfica Gil (2010, p.

REFERENCIAIS TEÓRICOS Para que ocorra melhor compreensão sobre o tema que será abordado neste capítulo algumas referências de renomados autores que abrangem vários aspectos relacionados à demanda de alimentos e uso de pesticidas no Brasil e no mundo será apresentada. Contexto histórico da demanda de alimentos é o uso de pesticidas A demanda crescente de alimentos para suprir às necessidades do aumento da população é o principal fator para a utilização em larga escala de pesticidas, os quais promovem maior produtividade, eliminando formas de vidas indesejáveis nas culturas agrícolas e pecuárias (SANCHES et al. A preocupação com esta forma de eliminação de pragas é um problema que deve ser tratado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, Ministério do Meio Ambiente pelo - MMA, pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MAPA, entre outros ministérios e órgãos públicos para que sejam estabelecidos limites máximos para o uso de pesticidas, pois é comprovada a toxicidade de grande parte desses compostos.

A regulamentação de agrotóxico que rege no Brasil tem como base a Lei nº 7. e com o Decreto nº 4. Além disso, os pesticidas orgânicos possuem alta atividade fisiológica, como os organoclorados e os organofosforados, sendo estes compostos com grande estabilidade física e química, o que faz com que persistam no meio ambiente (SANCHES et al. Essa classificação esta representada na Tabela 1. Tabela 1: Classificação dos pesticidas de acordo com suas estruturas químicas (continua). Grupo Pesticida Estrutura Tabela 1: Classificação dos pesticidas de acordo com suas estruturas químicas (continua). Grupo Pesticida Estrutura Tabela 1: Classificação dos pesticidas de acordo com suas estruturas químicas (continua). Os métodos oficiais para a análise de pesticidas são propostos por órgãos internacionais, como por exemplo, pela agência de proteção ambiental americana ou pela Farmacopeia Europeia.

Entretanto, nota-se que a principal diferença das metodologias ocorrem por causa da técnica de extração (extrações líquido-líquido e extrações em fase sólida), técnica de separação (cromatografia líquida ou cromatografia gasosa) e por conta das técnicas de detecção, contribuindo com a seletividade e sensibilidade do método (SABIN, 2007). Além disso, obtem-se melhor sensibilidade e seletividade analítica, utilizando-se a espectrometria de massas em modo de monitoramento seletivo de íons do que detectores seletivos como nitrogênio e fósforo e captura de elétrons (SABIN, 2007). Ainda segundo SABIN, (2007) as abordagens do tema pesticidas são geralmente direcionados conforme problema e demanda. Por exemplo, no caso do monitoramento de água para consumo, não pode ocorrer erros em relação à exatidão, pois os riscos e os custos para recuperação ambiental são elevados.

• Herbicidas: utilizadas contra ervas daninhas; • Inseticidas: utilizados contra inseticidas; • Fungicidas: utilizados contra fungos; • Bactericidas: utilizados contra bactérias; • Larvicidas: utilizados contra larvas; • Rodenticidas: utilizados contra roedores. No que pese a regulamentação brasileira em relação a pesticidas a Lei Federal nº 7. de 11 de julho de 1988, defini da seguinte maneira: Agrotóxicos e afins: (a) os produtos e os agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fatura, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos; (b) substâncias e produtos, empregados como desfolhantes, dessecantes, estimula e inibidores de crescimento (BRASIL, 1989, p.

Observa-se que a lei busca ressaltar uma visão neutra e genérica, sem apontar os possíveis danos dos agrotóxicos referente a saúde humano bem como o meio ambiente. Consequentemente, essa generalização é diferente a âmbito jurídico, estando presente frequentemente em diplomas legais. Nesse contexto os naturais são separados de fontes naturais, ou seja, isolados de plantas ou microrganismos, tais como os inseticidas abamectina e piretro (GERWICK; SPARKS, 2014; SENTHIL-NATAHAN, 2018). Inseticidas Orgânicos Sintéticos 3. Organoclorados Os organoclorados possuem em sua composição química carbono, hidrogênio e cloro, a ligação carbono-cloro é caracterizada por sua dificuldade em ser rompida, a presença do cloro diminui a reatividade de outras moléculas se tornando uma grande vantagem, essa baixa reatividade dos organoclorados quando entra em contato com o meio ambiente, faz com que sua degradação seja mais lenta e tendo pouca acumulação no ecossistema (NASCIMENTO; MELNYK,2016).

Suas características são baixa polaridade e baixa solubilidade aquosa, são usados como inseticidas podendo ser tóxicos para os animais e seres humanos. Alguns exemplos de pesticidas organoclorados incluem DDD, DDE, DDT, aldrina, dieldrina, metoxicloro, heptacloro, dicofol, pentaclorofenol, quintozena e toxafeno (SILVA, 2018). Figura 2 Alguns exemplos dos principais inseticidas organofosforados Fonte: NASCIMENTO; MELNYK, 2016 3. Carbamatos Os carbamatos são os pesticidas mais multifuncionais, com várias funções eles são herbicidas, inseticidas, antibacterianos e fungicidas. É derivado do ácido cabâmico e ésteres, sua ação também consiste em inibição da acetilcolinesterase, sua degradação é fácil, o que faz serem os pesticidas mais usados atualmente. Figura 3 Estrutura química do carbamatos Fonte: NASCIMENTO; MELNYK, 2016 3. Toxicidade As sustâncias tóxicas são aquelas que geram impactos negativos ao metabolismo dos seres vivos, podendo levar ao estabelecimento de anomalias fisiológicas e anatômicas.

No Brasil, por meio da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) vem ocorrendo um rigoroso acompanhamento de resíduos de agrotóxicos por meio do Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA). Entre 2013 e 2015 um estudo foi realizado tendo como base 12051 amostras com 25 alimentos com origem vegetal, tais como: cereais, frutas, hortaliças, raízes, entre outros. Alimentos esses que estão incluídos na dieta brasileira. As amostraram foram adquiridas de inúmeros estabelecimentos varejistas por todo o país. Nesse estudo 232 pesticidas distintos foram analisados nas amostras supervisionadas (ANVISA, 2016). A técnica consiste no uso de quantidades pequenas para amostra conhecida como picogramas, em concentrações baixas (parte por trilhão), criando informações importantes a respeito de diversas áreas, como na identificação de estruturas de biomoléculas, análise para confirmação e quantificação ao abuso de drogas, análise de impurezas ambientais dentre outros.

Segundo Meštrović (2019) define espectrometria em massa como: É o método analítico usado para identificar os compostos diferentes baseados na constituição atômica da amostra das moléculas e de seu estado da carga, que permite a análise das “cortinas” de uma amostra desconhecida sem nenhum conhecimento prévio de sua composição (MEŠTROVIĆ, 2019, p. Esse modelo da potencia analítica propiciou que esse procedimento seja visto como indispensável para aplicações tanto qualitativas como quantitativas. Figura 5 J. J. p. define Fontes Ionização como: “A Fonte de Ionização é a parte do equipamento responsável por converter os analitos de interesse em íons em fase gasosa, pré-requisito fundamental para qualquer análise por MS. A compreensão dos mecanismos envolvidos na ionização de cada uma das uma das fontes é de extrema importância, já que isso define quais os analitos possíveis de serem analisados” 4.

Fonte de ionização por DESI Fonte de ionização por DESI consiste em colocar a amostra numa superfície planar e os íons são desenvolvidos por gotículas de solventes que passam a ser carregadas de uma fonte tradicional chamada ESI (electrospray). Com isso os analitos que estão presentes na superfície são dissolvidos e ionizados. O MALDI é mais utilizado atualmente em análises clínicas, mas há grandes expectativas futuras para a análise biológicas com tecidos de plantas, para um conhecimento a respeito do estudo de compostos químicos presente nas superfícies após a adição de um agrotóxico, o que se faz um desafio para os presentes trabalhos e evidências científicas (ABDELNUR, 2011). Espectrometria de massas do tipo Tandem A espectrometria de massas tipo Tandem ela pode ser compreendida como a espectrometria de massas sequencial, tendo a necessidade de equipamentos certos que permitem a seleção específica para cada íon desejado.

Ele possui um analisador do tipo “triplo quadrupolo” (QqQ), onde um analisador quadrupolar (Q) é acoplado numa câmara de colisão que é preenchida com um gás inerte (q), no qual se conecta em um segundo quadrupolo (Q). Podendo ser operado em modos diferentes como: varredura, tandem (MS/MS) e monitoramento de reações múltiplas Multiple Reaction Monitoring – MRM. Na função do modo varredura o íon precursor é selecionado no primeiro quadrupolo (Q1) e os dois quadrupolos irão funcionar como os direcionadores de íons até chegar ao sistema de detecção (CAMPOS, 2015). CROMATOGRAMAS DE MASSAS 5. técnica de cromatografia A técnica de cromatografia consiste no acoplamento junto à espectrometria de massas obtendo o chamado cromatograma de massas. Ele é constituído pelos íons de interesse podendo ser adquirido atraves do acompanhamento dos íons selecionados (“selectedion monitoring”) – MIS, ajustado ao detector de massas para que sejam analisados somente os íons de razão m/z de interesse ou selecionando eles a partir de um banco de dados que contenha os espectros de massas (CHIARADIA et al.

Trata-se de uma metodologia com o objetivo de uma separação de componentes de uma amostra, por conta da sua distribuição entre fase estacionária (FE) e outra fase móvel (FM) de acordo com suas propriedades físico-químicas. A principal vantagem do emprego da cromatografia com dectecção acoplada a espectrometria de massas é que mediante a técnica é possível alcançar uma grande quantidade de informações estruturais sobre o analito,esse fato assegura uma maior exatidão de sua identificação, diferente quando ela é realizada apenas com base em suas características dos compostos analisados. A cromatografia líquida é um processo onde a separação de um composto ocorre pelo equilíbrio deste entre duas fases. Neste caso, entre uma fase estacionária sólida ou líquida e uma fase móvel líquida.

Historicamente, a cromatografia líquida não necessita necessariamente de uma instrumentação adequada, bastando dispor de uma coluna recheada com a fase estacionária por onde passa a fase móvel (PASSOS, 2012, p. É baseado nas suas características físico-químicas dos analitos tanto nas suas interações entre a fase móvel e sua fase estacionária, quando faz a passagem da fase móvel para a estacionária, são distribuídos os analitos pelas suas duas fases onde cada um deles é selecionado ficando retidos na fase estacionária, gerando migrações diferenciais (SILVA, 2015). Isso irá depender de seu mecanismo usado na separação, é possível desenvolver uma técnica de cromatografia por uma troca iônica, cromatografia também por exclusão, em fase normal ou em fase reserva.

Depois foram retomados com 2 mL de hexano e injetados no CGEM/EM da Varian. Em seguida foi feita uma avaliação da recuperação do Aldrin na matriz, e finalizando o estudo de eficiência da extração. Ao final do estudo eles analisaram que a utilização do sistema cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas teve um resultado bastante satisfatório, visto que é uma técnica bem recomendada para a confirmação da presença ou inexistência de substâncias que sejam suspeitas em amostras, na qual facilita a identificação dos analitos. Por meio de um outro estudo desenvolvido pelos autores Prates et. al (2011) que teve como objetivo desenvolver e vali­dar um procednimento opcional para o diagnostico de pesticida organoclorados utilizados por meio da cromatografia gasosa e espectrometria de massas para análise de águas superficiais e subterrâneas, teve como base a coleta de 31 amostras de poços semi-artesianos, nas pequenas propriedades em uma zona rural, os padrões dos pesticidas organoclorados foram obtidos da Supelco (USA) em uma ampola de 1 mL (TLC Pesticides Mix, lote LB 30319), 2000 mg mL-1 de aldrin; -HCB; -HCB; -HCB; -HCB; dieldrin; endosulfan I (alfa); endosulfan II (beta); endosulfan sulfato; endrin; endrin cetona; endrin aldeído; heptacloro; heptacloro epóxido isômero B; metoxicloro; 4,4'-DDD; 4,4'-DDE e 4,4'-DDT.

Na obtenção dos íons o metodo utilizado foi por meio do modo de acompanhamento de reações múltiplas (MRM). Os pesticidas foram adquiridos na empresa Sigma-Aldrich, com pureza superior a 98%(CASTRO et al. O padrão das soluções de estoque foram produzidas na concentração de 1000mg. L-1,depois da concentração foram feitas diluições de 100 mg. L-1 e11,5mg. Por fim o trabalho mostrou-se bastante produtivo devido não haver muitos estudos na área, assim servindo de base para novas pesquisas para os alunos e até mesmo para os segmentos relacionados. REFERÊNCIAS ABDELNUR, P. V. Imageamento químico por espectrometria de massas utilizando MALDI (MALDI Imaging Mass Spectrometry) aplicado a tecidos vegetais. ed. ANVISA. Agência nacional de vigilância sanitária. Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em alimentos (PARA), 2016.

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ANO III – Volume 1 - Número 1 2016. SABIN, G. m. et al. Pesticidas e seus respectivos riscos associados à contaminação da água. Pesticidas: R. Ecotoxicol. J. v. p. SENTHIL-NATHAN, S. Natural pesticide research. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2018. SOUZA, D. A. D. Efeitos da exposição pré e pós-natal de malathion sobre o Neurodesenvolvimento: possível associação causal com o comportamento autista. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, 2018. THURMAN, E. M. et al. Analysis of isobaric pesticides in pepper with high-resolution liquid chromatography and mass spectrometry: complementary or redundant?.