ATIVIDADES FARMACOGNÓSTICA, ANTIMICROBIANA, ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTITUMORAL DA ESPÉCIE VEGETAL Eleutherine plicata

Os extratos foram submetidos a ensaios biológicos. A atividade anti-inflamatória foi avaliada pelo método de migração de neutrófilos e testados nas concentrações de 1; 5 e 15 mg. A taxa de hemólise foi determinada utilizando concentrações de 150 µg/mL à 2. µg/mL. No teste antitumoral utilizou-se as células do  tumor ascítico de Ehrlich (TAE) e a viabilidade celular foi determinada pelo método colorimétrico de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) nos tempos de 24 e 48 horas, em concentrações que variaram de 1024 µg à 1 µg. Entre as espécies encontradas na região amazônica, a Eleutherine plicata (Herb), aparece como a espécie mais conhecida pela população que a utilizam popularmente para dores de barriga entre outros males. Inclusive esta espécie está inserida na relação nacional de plantas medicinais do Ministério da Saúde (RENISUS).

Em investigações etnobotânicas feitas por Jardim & Medeiros (2006) [3], no município de Santa Bárbara, ambos no estado do Pará, que ressaltaram o uso de Eleutherine plicata Herb. marupazinho) no tratamento de diarreia, possivelmente causada por ameba. O uso de chá dos bulbos da planta é muito utilizado na cultura chinesa no tratamento de ferimentos, diminuição do tempo de protrombina, vasodilatação coronariana, hemorróidas e infertilidade [4]. Na China e no Sudeste Asiático pode ser usada para tratar hemoptise, disenteria, menstruação irregular, dor abdominal, reumatologia, lesão traumática e ferida [14]. A E. plicata é uma planta medicinal de uso popular com grande potencial terapêutico. O objetivo deste trabalho é identificar os componentes químicos da E. plicata através de estudos farmacognóstico, avaliar o potencial anti-inflamatório e antitumoral, taxa de hemólise e atividade antimicrobiana dos extratos de clorofórmio e metanólico.

c) Análise para determinação de glicosídeos flavonoídicos presentes nos bulbos Aquilatou-se 2 g da droga seca e pulverizada, em um recipiente, sendo adicionados 15 mL de etanol a 75% (p/v). O recipiente foi submetido a aquecimento até a ebulição por alguns minutos, e em seguida arrefeceu e filtrou-se em papel filtro (Unifil). O filtrado foi reservado para executar as reações gerais de identificação que se seguem: a) Reação com hidróxido de sódio Diluiu-se o extrato com água, previamente destilada, tomou-se 5 mL do extrato diluído e, adicionou-se 2 gotas de hidróxido de sódio (Dinâmica) 5% (p/v). b) Reação com cloreto de antimônio Evaporou-se, em chapa aquecedora, 5 mL do extrato arrefeceu-se a cápsula de porcelana e dissolveu-se o resíduo com 5 mL de tetracloreto de carbono e adicionou-se 1 mL de pentacloreto de antimônio (Cinética) a 2% (p/v).

Análise para determinação de glicosídeos antraquinônicos presentes nos bulbos Nos testes de identificação para glicosídeos antraquinônicos foi realizada a extração da droga conforme descrito na Farmacopeia Brasileira, para posterior realização do teste seguinte, o procedimento realizado foi: Ferveu-se a 80°C cerca de 2 gramas da droga pulverizada com 30mL de álcool a 25% (p/v), durante 1 a 2 minutos. A partir dessa suspensão celular, injetou um total 200µL de células TAE intraperitoneal em dois camundongos a cada sete dias. Após cinco dias, o crescimento tumoral tornou-se evidente. Então as células foram obtidas a partir do lavado peritoneal, após as células foram lavadas por duas vezes em meio de cultura RPMI 1640 e centrifugadas por 5 minutos a 2000 rpm em temperatura ambiente.

Posteriormente foi realizada a contagem das células em câmara de Neubauer (diluição de 1:20 em líquido de Turk).  Avaliação da viabilidade celular para ensaios antitumorais A viabilidade celular foi avaliada pelo método de exclusão do azul de Tripan (18).   Análise da atividade antimicrobiana de Eleutherine plicata (Herb) A atividade antibacteriana foi avaliada a partir da metodologia de difusão em disco, de acordo com a metodologia padronizada pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011). O meio de cultura utilizado foi o ágar Mueller-Hinton e os microrganismos incluíram cepas padronizadas de Escherichia coli (Lote 17110R) e Staphylococcus aureus (Lote 1802R, New Prov), do laboratório de microbiologia da Faculdade Panamericana de Ji-Paraná (UNIJIPA). Para a realização do teste, impregnou-se os discos de papel filtro (6 mm) com as diferentes concentrações do extrato.

Em seguida, foram preparadas suspensões bacterianas em solução fisiológica (Eurofarma), obtendo-se turvação equivalente ao padrão 0,5 na escala de Mac Farland, que foram semeadas nas placas contendo o ágar Mueller-Hinton (Kasvi), e os discos foram posteriormente inoculados. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica (SP Labor) a 37ºC por um período de 24 horas. Ao todo foram contadas 100 células por lâmina, diferenciando-as em quatro tipos celulares: neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mononucleares. Os resultados foram devidamente expressos como nº de neutrófilos x 106/ mL.  Ensaio Hemolítico Os animais foram eutanasiados por aprofundamento anestésico empregando-se cetamina (Cetamin) 150mg/Kg e xilazina ( Calmiun) 7,5mg/Kg. A cavidade peritoneal foi lavada com 3 mL de PBS/EDTA (tampão fosfato/ ácido etilenodiamino tetra-acético) (Dinâmica Brasi)l 5% (p/v) e, a partir do exsudato foi realizada a contagem total e diferencial das células presentes.

O sangue dos camundongos centrifugado e lavado 3x com PBS (tampão fosfato) (Sigma /USA). Tabela 3- Resultados das reações indicativas da presença ou ausência de glicosídeos flavonoidicos Reagente Coloração Resultado Hidróxido de sódio coloração amarela, que varia de intensidade com o armazenamento. Positivo Reação com cloreto de antimônio Formou-se uma coloração amarelada em forma de anel. Positivo Na reação com hidróxido de sódio houve alteração de coloração para a cor amarela e no outro teste com cloreto de antimônio observou-se uma coloração amarelada. Nas duas reações obtiveram resultado positivo para a presença de glicosídeos flavonoidicos, os quais, de acordo com a metodologia utilizada, considera resultado positivo quando se desenvolve coloração amarela na reação com hidróxido de sódio e com coloração amarelada utilizando cloreto de antimônio.

Outra classe de glicosídeos analisados foram os antraquinônicos e as reações apresentaram resultado positivo para presença de glicosídeos antraquinônicos na forma reduzida (Tabela 4). A viabilidade celular do extrato metanólico no período de 24 horas foi significativamente menor nas concentrações de 16, 64, 128, 256 e 512 µg. Entretanto no período de 48 horas observa-se que nas concentrações de 1, 16, 32, 64, 128, 512 µg a viabilidade celular foi inferior em relação ao controle. Análise da atividade antimicrobiana de Eleutherine plicata (Herb) A atividade antibacteriana foi avaliada a partir da metodologia de difusão em disco. Utilizaram-se as concentrações de 1024; 512; 256; 128; 64; 32 e 16 µg/Ml dos extratos hexanóico ou metanólico e os antibióticos ampicilina e penicilina como controle positivo e o controle negativo, a solução fisiológica. A avaliação da ação antimicrobiana sobre duas espécies de bactérias E.

coli (EM) 11* 10* -- -- -- -- -- ** 40* -- S. aureus (EM) -- -- -- -- -- -- -- 41 ** -- O tamanho do halo de inibição foi expresso em mm e observa-se que apenas em E. coli com extrato metanólico nas concentrações de 1024 e 512 µg/Ml com halos de tamanho de 11 e 10 mm, respectivamente, porém com valor inferior ao encontrado no controle positivo (penicilina). Avaliação do efeito anti-inflamatório do extrato hexânico e metanólico Eleutherine plicata (Herb) Para a avaliação do efeito anti-inflamatório de Eleutherine plicata (Herb) foram utilizados extratos hexânico e metanólico da planta nas seguintes concentrações: 1mg/kg, 5mg/kg e 15mg/kg. E os resultados estão expressos na figura 3. plicata (Herb) apenas nas concentrações de 150, 75 µg/mL houve uma porcentagem de hemólise significativamente superior ao controle negativo (PBS), porém com valores inferiores ao controle positivo (Triton).

Enquanto que o extrato metanólico não apresentou efeito hemolítico significativo sobre as células vermelhas em nenhuma concentração estudada. DISCUSSÃO A espécie Eleutherine americana (Merr) apresenta metabólitos secundários, com a presença de atividades biológicas como: compostos isolados e elucidades de antraquinonas, naftoquinonas e naftalenos. Foram realizados estudos para validação de usos farmacológicos desta espécie, especialmente para avaliar ação como antimicrobiano, anti-hipertensivo, antidiabético, anti-inflamatório e antivirail contra o HIV [22]. Estudos realizados com a espécie Eleutherine plicata (Herb) foram identificados os principais grupos de compostos orgânicos com a presença de: alcalóides, antraquinonas, flavonóides, saponina espumídica, taninos, ácidos orgânicos, açúcares redutores, azulenos, carotenóides, catequinas, depsídios e depsidonas, derivados benzoquinas, derivados da cumarina, esteróides e triterpenóides, glicosídeos cardíacos, lactonas, polissacarídeos, proteínas e aminoácidos e purinas [23].

Podem estar presentes como fármacos, seja nas formas livres (aglicona ou geninas) ou ligadas a glicídios (na forma de glicosídeos antraquinônicos) [30]. Os compostos quinônicos, também conhecidos como quinonas, são classificados como compostos químicos amplamente conhecidos dentro do contexto da química, em especial a das plantas superiores [31]. As reações apresentaram resultado positivo para presença de glicosídeos antraquinônicos na forma reduzida (Tabela 4), observando-se a formação de uma coloração amarela na reação indicativa de antraquinonas. No que se refere aos estudos anti-inflamatório da espécie Eleutherine plicata (Herb) não foram localizadas pesquisa já realizadas para a discussão dos resultados, sendo que são encontrados outros estudos como antioxidante e anti- microbiano, assim como vários estudos com o gênero Eleutherine.

De acordo com Padhi e Panda (10) (2015) registram em seus estudos sobre a atividade antibacteriana de Eleutherine bulosa (Merr) contra resistência a múltiplos fármacos. Porém não foram apresentados resultados positivos que evidenciam esse efeito através dos extratos metalónico e hexânico produzidos da espécie vegetal Eleutherine plicata (Herb). De acordo com estudos realizados a espécie Eleutherine plicata tem indicação medicinal através do uso popular para diarreia e a forma de preparo acontece por infusão [34]. Cadastrada na Relação Nacional de Plantas medicinais de interesse ao SUS (RENISUS), tendo como principal indicação o tratamento de diarreias. Como atividade antibacteriana positiva, considerou-se a formação de halos de inibição (HI) iguais ou superiores a 6 milímetros de diâmetro (DE-BONA et al.

Observou-se que as frações apresentam atividade antimicrobiana apenas utilizando extratos metanólicos nas concentrações de 1024 e 512 µg com valores de halos de 11 e 10 mm, respectivamente, porém apenas em E. Para os estudos antitumorais foram avaliados através dos extratos hexânico e metanólico dentro de um intervalo de tempo de 24 horas e 48 horas. No extrato hexânico a viabilidade celular foi apresentou baixo comprometimento em ambos os intervalos de tempo estudado. Enquanto nos testes antitumorais com extrato hexânico observou-se que a diluição de 12 µg em 24 horas apresentou uma taxa de viabilidade celular de aproximadamente 40%, sendo que a diluição no período de 48 horas também foi significativa, porém não se manteve durante o período de avaliação. A atividade antimicrobiana apresentou halos de inibição significativos apenas no extrato metanólico sobre E.

coli nas concentrações de 1024 e 512 µg/Ml, porém não significativos em relação à penicilina. p. cnptia. embrapa. br/digital/bitstream/item/83550/1/EstudoFenologico. pdf (3) JARDIM, M. C. S. Isoleuterol e Isoleuterina: Potenciais marcadores químicos da tintura de Eleuterine plicata Herb. Iridaceae) e atividades microbiológica e antioxidante. Dissertação (mestrado), Belém, 2008, 67p. O USO DE ELEUTHERINE PLICATA NO TRATAMENTO DE DOENÇAS GASTROINTESTINAIS NA AMAZÔNIA PARAENSE. Anais do VIII Congresso de Ecologia do Brasil, 23 a 28 de Setembro de 2007, Caxambu -– MG. BARAÚNA, R. A. NEVES, A. AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA E FARMACOLÓGICA DO EXTRATO AQUOSO DE ELEUTHERINE PLICATA. ª Reunião Anual da SBPC, 2007. MENEZES, T. O. A. ALVES, B. P. MENDONÇA, L. C. V. S. B. MOREIRA, L. E. L. ° Congresso Brasileiro de Química, 2009.

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