Alcaloides de Erythrina velutina como possíveis agentes terapêuticos para Doença de Alzheimer

A incidência da DA está diretamente relacionada ao aumento da idade da população. Atualmente, o arsenal terapêutico desta doença limita-se a algumas substâncias com ação na inibição da enzima colinesterase que bloqueia os efeitos da redução da acetilcolina, resultando em um efeito neuroprotetor. Esta terapia apenas tem a capacidade de melhorar a qualidade de vida, mas não evita a progressão da doença. Os impactos na economia dos países frente aos custos com a saúde são relevantes por se tratar de uma doença que possui tratamento prolongado e contínuo e a busca por novos tratamentos torna-se relevante para aumentar as estratégias terapêuticas além da procura de novos alvos moleculares para o tratamento de DA.

Por isso, novas opções de compostos ativos derivados de plantas tornam-se interessante devido à grande biodiversidade de plantas medicinais encontradas no país, principalmente no bioma da Caatinga exclusivo apenas no território brasileiro. Fonte: Alzheimer’s Disease Research, acesso em 24/06/2019. A característica dessa alteração é a presença de placas senis resultantes do metabolismo anormal da proteína precursora do peptídeo amiloide (APP), acarretando a formação de agregados b-amiloide e emaranhados neurofibrilares que se formam a partir do colapso do citoesqueleto neuronal, decorrente da hiperfosforilação da proteína tau (FORLENZA, 2005). Outro elemento crítico para o desenvolvimento do DA é a diminuição de acetilcolina no cérebro que pode ser crítico na demência (BECKER et al. Segundo um estudo de Prince et al. em 2010 aproximadamente há 35,6 milhões de pessoas com demência no mundo e acredita-se que estes números dupliquem a cada 20 anos.

Na tabela 1 estão descritos os medicamentos aprovados pela agência Food and Drug Administration (FDA) para a terapia DA. Tabela 1: Medicamentos aprovados pela agência Food and Drug Administration (FDA) para a terapia da Doença de Alzheimer. Princípio Ativo Nome Comercial Mecanismo de Ação tacrina Tacrinal® Inibidor de colinesterases galantamina Reminyl ER® Inibidor de colinesterases donepezila Eranz® Inibidor de colinesterases rivastigmina Rivastigmina® Exelon Patch® Inibidor de colinesterases memantina Ebix® Alois Gotas® Antagonista não competitivo de receptores NMDA A memantina apresenta como mecanismo de ação ser um antagonista não competitivo dos receptores NMDA inibindo a ação do glutamato, apresentando neuroproteção em relação a excitotoxicidade deste neurotransmissor, permitindo a neurotransmissão e os mecanismos de neuroplasticidade dos neurônios funcionais (ENGELHARDT et al.

Os outros quatro medicamentos aprovados tem em comum apresentarem como mecanismo de ação a inibição da enzima acetilcolinesterase porém não são aprovados para o uso na fase avançada da doença (BRASIL, 2010). Dentre seus princípios ativos, tacrina, rivastigmina, donepezil e galantamina, destaca-se que a rivastigmina é um derivado semissintético do alcaloide indólico fisiostigmina, enquanto a galantamina é um alcaloide isoquinolínico obtido principalmente de espécies da família Amaryllidaceae. RIBEIRO et al. Apresenta como constituintes químicos alcaloides, flavonoides, isoflavonóides, sendo a principal fonte de alcaloides tetracíclicos do tipo eritrina (NKENGFACK et al. Popularmente a decocção do caule de E. velutina é empregada para o alívio da tosse e tratamento de bronquites, além do uso para verminoses, hemorroidas, picadas de lacraia e escorpião, os frutos secos usados como anestésicos e sedativos (AGRA et al.

CARVALHO, 2008). foi desenvolvido um extrato etanólico padronizado de E. velutina  e investigou-se o potencial neuroprotetor do extrato bruto e do ácido rizônico (RA) de E. velutina em células neuronais, onde se mostraram atuando como antioxidante sobre os neurônios, sugerindo um possível mecanismo para comprovar seu efeito neuroprotetor. Outro indício da ação neuroprotetora observada para alcaloides de E. velutina está relacionado à inibição dos receptores nicotínicos de acetilcolina (ITURRIAGA-VASQUEZ et al, 2010). É importante destacar que não há modelos animais que possam mimetizar todos os sintomas cognitivos, comportamentais, bioquímicos e anormalidades histopatológicas observadas dentro da DA. O processo de neurodegeneração latente envolvido na doença ocorre espontaneamente apenas em seres humanos. Entretanto, uma reprodução parcial da neuropatologia e dos déficits cognitivos provenientes da doença de Alzheimer tem sido alcançada através de abordagens genéticas e farmacológicas, mas a falta de um modelo animal padrão torna o estudo de uma potencial terapia para a DA mais complicado (YAMADA e NABESHIMA, 2000).

ZEBRAFISH O zebrafish é um pequeno teleósteo, da espécie Danio rerio presente em regiões tropicais com hábitat em água doce. Apresenta como vantagem, prática e experimentação executável em espaços reduzidos, por serem peixes de porte pequeno de fácil manutenção alta taxas de reprodução, com sequência genômica homóloga aos mamíferos. E. velutina é uma planta com uso popular consagrado e tem efeitos terapêuticos diversos, incluindo ação antioxidante e ação sobre receptores muscarínicos, tendo como efeitos já descritos na literatura atividade neuroprotetora e ação contra a DA. Ainda, produz alcaloides isoquinolínicos bioativos com grande rendimento em suas sementes e potencial biológico em SNC. Por isso, consideramos esta planta com um potencial importante para o desenvolvimento de novos produtos naturais (alcaloides) como protótipos para o tratamento da DA.

O uso do modelo animal de zebrafish para o estudo comportamental e de toxicidade é uma alternativa eficaz e rápida e reprodutível que substitui a discutível utilização de roedores e ainda atende às atuais exigências de protocolos internacionais de estudo animais. b) Obtenção do extrato hidroalcoólico As etapas relacionadas aos aspectos fitoquímico serão realizadas conforme protocolos já estabelecidos (Almeida, 2018, Chacon, 2018). As sementes selecionadas serão fragmentadas, trituradas em liquidificador industrial e tamisadas para obter uma maior área de contato com o solvente extrator, aumentando a eficiência da extração. O extrato bruto (EB) será obtido através da maceração hidroalcoólica (96:4, v/v - etanol:água), durante 48 horas em temperatura ambiente na proporção de 1 g de planta para 10 mL de solvente, seguida de filtração a vácuo e rotaevaporação.

O processo será repetido 5 vezes. O EB será armazenado em recipiente fechado ao abrigo da luz, umidade e calor até ser utilizado para obtenção da fração enriquecida de alcaloides utilizando o método de partição liquido-liquido. As zonas de absorção visualizadas serão retiradas das placas cromatográficas, identificadas, solubilizadas com metanol, filtradas e submetidas à rotaevaporação. e) Análises cromatográficas A análise preliminar do extrato e seus alcaloides será realizada através de CCD utilizando-se cromatoplacas de sílica gel 60GF254 de fase normal, como fase estacionária, acetato de etila, n-butanol e hidróxido de amônio (8:1:0,5 (v/v/v) como fase móvel. A Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) será utilizada como ferramenta de análise de pureza e caracterização estrutural dos constituintes do extrato bem como dos alcaloides isolados.

Um método previamente padronizado pelo grupo de pesquisa será utilizado em que a análise será feita com o injetor do modo split, a uma temperatura da coluna de 100°C e temperatura de injeção de 250°C. O gás de arraste empregado será o gás Helio, com um fluxo total de 48. A exposição crônica à concentração final de 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 µl/L de extrato, será conseguida diluindo o extrato hidro-alcoólico em água do sistema de zebrafish. Os alcaloides isolados serão testados posteriormente. Soluções serão preparadas em tanques de vidro de 2L, que serão usados ​​como tanques de peixes. Para cada concentração de extrato, 10 zebrafish adultos serão adicionados a cada um dos 3 tanques contendo 2 L da solução final. As soluções serão preparadas diariamente, devido à meia-vida desconhecida do extrato de Erythrina velutina.

Serão utilizadas 5 concentrações, correspondentes a concentração subletal, 1/4 da concentração subletal, 1/3 da concentração subletal, 1/2 da concentração subletal e o controle (água). Observações diárias do desenvolvimento dos embriões serão avaliadas através dos seguintes parâmetros: desenvolvimento de olhos, edema cardíaco, anencefalia, espaçamento de cauda, presença de córion, presença de coágulos, pigmentação, batimentos cardíacos, mau formação de cabeça e cauda, absorção do saco vitelínico, equilíbrio postural e mau formação de coluna vertebral. Os embriões serão fotografados a cada estágio de desenvolvimento e os dados coletados serão comparados entre os tratamentos. EFEITOS NA COGNIÇÃO 3. INDUÇÃO DE PERDA COGNITIVA: PRIVAÇÃO DE SONO A luz tem efeito supressivo poderoso no sono do zebrafish e o ciclo extendido somente induz rebote de sono a partir de 20 dias de privação.

Assim, o teste de discriminação de objetos ocorrerá em três fases: (1) aclimatação em tanque, (2) fase de memorização e (3) fase de discriminação. A fase de aclimatação e memorização ocorrerão durante o tratamento de privação de sono e exposição aos alcaloides eritrina e erisodina. Para os objetos a serem discriminados, serão utilizados cubos de plástico Lego® (4x4x4 cm) com cores completamente randomizadas para evitar preferencia entre objetos. A fase de aclimatação (1) terá duração de cinco dias. Os peixes poderão explorar o tanque de teste por 15 min por dia, sem objetos, para se acostumar com a nova arena e reduzir o estresse da novidade. O comportamento de exploração dos peixes será novamente filmado por 15 min. Em ambas as fases, a permanência do animal em uma área de 3 cm ao redor dos objetos será considerada comportamento de exploração (LUCON-XICCATO e DADDA 2014).

O comportamento registrado em video será analisado ​​usando um software de rastreamento multi-alvo denominado ZebTrack \ UFRN, desenvolvido em MATLAB (R2014a; Math Works, Natick, MA) e serão avaliados os seguintes parâmetros comportamentais: velocidade média e máxima de natação, distância percorrida e tempo de exploração de cada objeto. Os parâmetros de velocidade média e máxima de natação e distância total percorrida serão avaliados por teste de ANOVA one-way para comparação entre os grupos experimentais. O tempo gasto em torno dos objetos (até 3cm de distância de cada lado dos objetos) será usado para estimar a exploração (Lucon-Xiccato e Dadda 2014) e compararemos o tempo de exploração dos objetos nas fases de memorização e discriminação, e também entre as duas fases para cada grupo experimental.

Finalmente, espera-se que através de artigo científico de impacto maior que 4,0 a comunidade internacional reconheça a Caatinga como celeiro de moléculas bioativas. Cronograma Físico e Financeiro Atividades \ bimestres 1o 2o 3o 4o 5o 6o 7o 8o 9o 10o 11o 12o 1 Acompanhamento da literatura e cumprimento dos créditos X X X X X X X X X X X X 2 Obtenção do extrato bruto, isolamento e elucidação estrutural dos alcaloides X X X 3 Execução dos testes in vivo em modelo zebrafish (toxicidade e cognição) X X X X X X X X X 4 Análise dos resultados e redação de artigo científico X X X X X X X X X 5 Qualificação e defesa da dissertação X X 9 Relatórios científicos X X X X Referências AGRA, M.

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