RELATÓRIO CONFECÇÃO DE PRIMERS PARA O GENE DO DALTONISMO

OBJETIVO. MATERIAIS E MÉTODOS. Materiais. Métodos. CONCLUSÃO. NCBI, 2019). OBJETIVO Analisar e confeccionar um par de primers adequado para pesquisa sobre o daltonismo. MATERIAIS E MÉTODOS 3. Materiais ▪ Computador; ▪ Sites utilizados: o National Center for Biotechnology Information (NCBI) o Primer 3 plus o Site OligoAnalyzer 3. Métodos 1º Acessar o Google e pesquisar o banco de dados da NCBI (Centro Nacional de informações Biotecnológicas), clicar em All Databases e selecionar a categoria Gene; 2º Adicionar a doença (Daltonismo) na barra de pesquisa e trocar a categoria Gene; 3º Selecionar um gene relacionado a ela (Opn1mw) dentre os listados e selecionar; 4º Analisar as características desse gene e realizar observações; 5º Clicar em FASTA selecionar toda sequencia de bases do gene Opn1mw; 6º Abrir o programa Microsoft Word e colar a sequência copiada e visualizar a quantidade de bases clicando em palavras na barra inferior e anotar os dados dos caracteres sem espaço que se refere ao total de bases; 7º Acessar o Google e pesquisar o site Primer 3 Plus clicar em General Settings (Configurações Gerais) e deixar a opção de Mispriming/Repeat Library em NONE (nenhum); 8º Voltar no campo anterior MAIN e colar a sequência de bases obtidas do gene através do NCBI clicar em Pick Primer (Gerar Primer); 9º Analisar os dados obtidos no Primer 1 e Primer 2, como Comprimento do Primer, temperatura de Melting (TM), porcentagem de Guanina e Citosina (GC) e o tamanho do amplicon (Product Size).

Na imagem 2 podemos observar o tamanho mínimo, ótimo e máximo para o tamanho do primer, é possível observar que o tamanho ideal é de 20 pares de bases. Em seguida a Temperatura de Melting, que é a temperatura necessária para o anelamento das fitas, a mínima é de 57 a ótima 60 e a máxima de 63 e por último a quantidade em % de Guanina e Citosina que é ideal 50%. Imagem 2: Propriedades essenciais para criação do primer. Após observações das características da doença iniciamos a criação do primer com o aplicativo Primer 3 Plus, uma ferramenta importante para darmos início na criação. Com ela obtemos a sequência de cinco pares de primers possíveis. Imagem 8 - Análise do Hetero-dimer Em seguida analisamos o pareamento entre os pares de bases no HeteroDimer e foram encontradas 5 possibilidades entre os dois primers, mas todos com apenas 2 ligações entre eles dentro da margem de segurança.

Analisamos o primer Forward e tivemos a garantia de que ele é ideal para a reação e agora iremos repetir o processo para análise do primer Reverse. O primer reverse foi de sequência 3’- 5’: CCCTCCCACAGTCACAACTC, e abaixo citamos as propriedades. Imagem 8 Propriedades Primer Reverse Imagem 9 Análise Primer Reverse Hairpin Imagem 10 Estrutura 1 Harpin em preto Imagem 11 Estrutura 2 Hairpin No primer Reverse observamos 2 possibilidades para a formação de alça na estrutura 1 com temperatura 22,9°C e a Estrutura 2 com 10°C, visto que a Temperatura de Melting ideal para esse primer é de 57,6°C conforme a imagem 8, então não irá ocorrer a formação de alça já que para termo uma margem de segurança esse valor deve ter uma diferença de 20°C entre eles e nesse caso está dentro da margem.

Imagem 12 Análise Primer Reverse self-dimer Conforme a imagem 12 encontramos 4 possibilidades para o anelamento entre o próprio primer (Self-Dimer), mas todos abaixo de 4 sendo assim está dentro da margem de segurança, não tem possibilidade deles se anelaram. pdf?sequen ce=1&isAllowed=y>. Acesso em: 22 mar. MEDICINA, U. s National deficiency. Disponível em: Library Of (Org. unesp. br/Home/Departamentos/Fisiologia/Neuro/08. senti do_visao. pdf>. Acesso em: 03 abr. bioinformatics. nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus. cgi>. Acesso em: 15 abr. TECNOLOGIES, Integrated Dna (Org.