Identificação de danos no DNA em sementes de melão Cucumis melo L processadas por plasma frio

Grande área de conhecimento (CAPES/CNPq): Ciências biológicas Sub-Áreas de conhecimento (CAPES/CNPq): Genética vegetal – Biologia Molecular Duração do Projeto: 9 meses Instituição: Universidade Federal Rural do Semi-Árido Participantes do Projeto: Belícia Santana da Silva (Coordenador) Estudante de Iniciação Científica, Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal Rural do Semi-Árido Departamento de Ciências Vegetais/Centro de Ciências Agrícolas/UFERSA Experiência profissional: Biotecnologia vegetal, com ênfase em pré-melhoramento de espécies vegetais, utilizando marcadores moleculares RAPD e ISSR. Laysa Ohana Alves De Oliveira (Subcoordenador) Estudante de Iniciação Científica, Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal Rural do Semi-Árido Departamento de Ciências Animais/Centro de Ciências Biológicas e da Saúde/UFERSA Experiência profissional: Produção in vitro de embriões no Laboratório de Transplantes Gonadais e Produção In Vitro de Embriões.

JohnyWysllas De Freitas Oliveira (Subcoordenador) Estudante de Iniciação Científica, Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal Rural do Semi-Árido Departamento de Ciências Vegetais/Centro de Ciências Agrícolas/UFERSA Experiência profissional: Bioinformática, Biologia Molecular e Bioquímica. Dr. CLODOMIRO ALVES JUNIOR (Colaborador) Professor Titular da Universidade Federal Rural do Semi-Árido Departamento de Ciências Exatas/Centro de Ciências Exatas Coordenador do Laboratório De Plasma Experiência profissional: Engenharia de Materiais e Metalúrgica, com ênfase em Processamento de materiais por plasma Taffarel Torres Melo (Colaborador) Professor Titular da Universidade Federal Rural do Semi-Árido Departamento de Ciências Animais/Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Coordenador do Laboratório De Engenharia genética genômica e proteômica Experiência profissional: Bioquímica, Estresse Oxidativo, doença de chagas, Metabolismo.

Citometria de fluxo-------------------------------------------------------------------------------------17 4. Análise estatística--------------------------------------------------------------------------------------18 5. Resultados e discussões------------------------------------------------------------------------------18 5. Análise do perfil morfológico------------------------------------------------------------------------18 5. Teste cometa-------------------------------------------------------------------------------------------19 5. Contudo o processamento por plasma pode ser aplicado na busca por erradicação deste problema, possibilitando a redução dos patógenos que acometem a espécie e sem causar danos ao meio ambiente. Entretanto o processamento por plasma frio pode afetar a estrutura do DNA, gerando danos a genética do meloeiro. Desta forma para a realização de analises será necessário adquirir sementes de melão, tratá-las como plasma frio e após o ensaio de cometa deve ser feita a citometria de fluxo para maior confiabilidade dos resultados. Posteriormente todos os dados serão analisados estatisticamente. Para obter uma maior compreensão do efeito do processamento por plasma frio sob a genética das sementes de melão.

Sendo os melões alimentos considerados como boa fonte de sódio, potássio e vitamina C. SECCO et al. A produção nacional de melão está concentrada em sua maior parte na região do Nordeste Setentrional, que compreende os estados do Rio Grande do Norte e Ceará, a qual fornece cerca de 80% de toda a produção nacional. Desse total, o Rio Grande do Norte é responsável por aproximadamente 60% cuja produtividade se concentra principalmente na microrregião do agropólo Mossoró-Assú, o ponto de partida para o cultivo de melão em nosso estado desde 1980 (AGRIANUAL, 2012; AROUCHA et al. O cenário atual do mercado fruticultor, especialmente àquele voltado à exportação, é exigente e requer melões com alta qualidade. O míldio é uma das mais importantes doenças do meloeiro no Nordeste brasileiro, podendo reduzir a produção de frutos e o teor de sólidos solúveis totais em até 60% e 49%, respectivamente.

O oídio, também, é uma doença de grande influência sob o meloeiro, devido a sua capacidade de reduzir o rendimento da cultura, tanto pela diminuição do tamanho e/ou do número de frutos, como pelo encurtamento do período produtivo das plantas (SANTOS; CRISÓSTOMO; CARDOSO, 2004) Em altas temperaturas e baixa umidade no campo, as epidemias do oídio são mais intensas e duradouras. Apesar de serem conhecidos vários agentes causadores de oídio, as espécies Erysiphecichoracearum DC e S. fuliginea são as mais freqüentes e importantes para o meloeiro, enfatizasse que a espécie S. fuliginea é a única encontrada em cucurbitáceas no Brasil. MISRA et al. GADRI et al. AFSHARI & HOSSEINI, 2014). Aplicação do plasma atmosférico frio e seu mecanismo de ação A capacidade que o plasma atmosférico frio tem de produzir componentes causadores de modificações químicas e de poder provocar a catálise de diversos materiais possibilita a sua utilização no campo médico (inativação de células anormais, esterilização de equipamentos e eliminação de micro-organismos), na área ambiental (tratamento de resíduos) e na indústria de alimentos (descontaminação de superfícies) (STOFFELS; SAKIYAMA; GRAVES, 2008; PUAC et al.

VOLIN et al. Ainda assim, trabalhos relacionados a danos no DNA de meloeiros que tiveram sementes submetidas ao tratamento por plasma frio possuem uma literatura escassa. Tecnologia de análise de danos de DNA O ensaio cometa ou técnica de eletroforese em célula única (SCGE), é um teste utilizado para identificar danos no DNA causados por agentes oxidantes, alquilantes e intercalantes. Esse tipo de teste é vantajoso por ser bastante sensível, rápido na apresentação do resultado e por possuir um baixo custo (SINGH et al. O SCGE mede lesões no DNA através da migração de fragmentos, identificando quebras de cadeias simples (BETTI et al. Esse método foi descrito por Ostling e Johanson (1984), onde as células eram depositadas em agarose e submetidas à eletroforese após serem expostas a um agente mutagênico.

Realizar o tratamento das sementes com plasma frio. Analisar o DNA e os seus possíveis danos causados pelo tratamento com plasma utilizando o método por citometria de Fluxo. Analisar o DNA e os possíveis danos causados pelo tratamento com plasma utilizando o método de ensaio cometa. Comparar a aplicação do plasma sobre diferentes tempos, para analisar a interferência do tempo sobre os possíveis danos sofridos no DNA. Estabelecer correlações entre o tratamento de plasma e possíveis danos causados ao DNA. na qual ele utiliza uma fonte de plasma não térmico de descarga coplanar de barreira de superfície coplanar (DCSBD) com utilização da pressão atmosférica ambiente. A geometria do eléctrodo DCSBD é constituída por muitos eletrodos de prata paralelos de tiras e linhas incorporados a 0,5 mm abaixo da superfície de 96% de cerâmicas Al2O3.

O DCSBD gera na placa de Alumina uma fina camada de plasma macroscopicamente homogêneo. A espessura efetiva da camada de plasma medida utilizando uma câmara CCD pode ser estimada em cerca de 0,3 mm que dá às condições experimentais usadas a elevada densidade de potência de plasma de cerca de 100 W / cm3. A descarga foi alimentada por tensão sinusoidal de 14 kHz com amplitude de aproximadamente 10 kV, fornecida por uma Fonte de Alimentação de Plasma HV. Após ocorre a incubação do material num tampão de eletroforese alcalino(300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH 12. a 4 ° C durante 40 minutos para promover a libertação de histonas (AZAQUETA et al. A eletroforese será realizada sob as seguintes condições: corrente constante de 300 mA, temperatura entre 4°C (para evitar danos ao DNA), durante 20 min empregando 1,15 V / cm (FAINRBAIN et al.

Após a eletroforese, as amostras serão lavadas em um tampão neutralizante (com 0. M Tris (pH 7. Os resultados serão obtidos utilizando a versão 3_0 do software SYSTEM. Antes da análise, o instrumento foi verificado quanto à linearidade com pontas fluorescentes, e as configurações de amplificação serão mantidas constantes durante todo o experimento. O coeficiente máximo de variação de pico (FCPV) será coletado a partir da intensidade de fluorescência (FL), onde a partir dessa variação de intensidade do pico caracterizará regiões com modificações no DNA. Para a análise, os arquivos de citometria de fluxo serão transformados em arquivos de histograma simples com o software WinMDI ver 2. e depois analisados ​​usando o software Cylchred, na qual os dados resultantes foram tratados usando o Microsoft Office Excel 2010.

Teste cometa Após a aplicação do teste cometa e visualização com a utilização da câmera Nikon Eclipse 80i, as amostras apresentaram um caráter peculiar. As amostras que não sofreram tratamento (Controle negativo) com plasma apresentaram uma altíssima frequência de F – 0 (99%) e apenas 1% de F - 1, enquanto a F – 2 teve 0%, onde a F – 2 indica a formação de danos ao DNA das sementes (Fig. Nos três tratamentos é possível perceber a diminuição da frequência de F – 0 e o aumento da frequência de F – 1 e F – 2 a medida que o tempo de tratamento aumenta. No tratamento de 10 minutos percebemos a F – 0 de frequência de 92% e que a de F – 1 em 8 %, porém a F – 2 permanece 0%. Já no tratamento de plasma por 20 minutos F – 0 apresenta uma frequência de 72%, enquanto F – 1 apresentou 22% e F – 2 6%.

Sendo possível analisar isso quando comparamos os grupos controle negativo e positivo, onde a frequência dos picos do grupo controle negativo variam de 400 nm até 436 nm enquanto o grupo do controle positivo varia de 435 a 600 nm, uma vez que ainda utilizando os dados do teste cometa, apresentou uma pequena fração de amostras que não sofreram danos, por isso a presença ainda de picos menores. O grupo de tratamento que durou 10 minutos, teve uma variação da frequência dos picos entre 400 nm a 437 nm, bem próximo ao controle negativo, indicando que possivelmente que se o negativo não apresenta a formação de grânulos o tratamento com 10 minutos de plasma, não seria prejudicial também para a mesma. O grupo que teve o tratamento que durou 20 minutos, apresentou uma variação na frequência dos picos de 420 a 472 nm, na qual apresenta formação de grânulos e possível caracterização de danos ao DNA.

E o de 30 minutos teve uma variação da frequência dos picos 430 nm a 537 nm, uma vez que apresentou amostras com danos ao DNA e amostras sem danos, tomando como base o teste cometa. O plasma é uma mistura de gases ionizados, elétrons, íons positivos e negativos, radicais livres e fótons energéticos, entre outros (GRAVES, 2008), tais componentes reativos são capazes de causar modificações na superfície de materiais e de desencadear cascatas biológicas dependendo do organismo utilizado no tratamento e dos aspectos relacionados à produção desse plasma (VOLIN et al. As letras semelhantes indicam semelhança estatística com base no teste ANOVA-oneway considerando o teste T de Tukey(p < 0,05). Conclusão Conclui-se que o tratamento de plasma é eficiente para o tratamento de plantas, por auxiliar no seu crescimento e por dificultar pragas, porém quando o mesmo tratamento é aplicado por um grande período de tempo, pode ocasionar diversos danos ao DNA.

Onde um período de 10 minutos foi caracterizado com um período de tempo ideal que não ocasiona praticamente nenhum dano ao DNA e que após a aplicação essas sementes apresentariam os benefícios do tratamento com plasma frio para um melhor cultivo dessa semente. Os demais tratamentos de 20 e 30 minutos, acarretaram danos ao DNA que poderiam ser consideravelmente prejudicial tanto para o acesso como também para a própria semente. Foi perceptível também as alterações morfológicas de rugosidades e sinais de ressecamento nas sementes, modificações essas que aumentavam gradualmente de acordo com o tempo do tratamento. AGUIRRE, D. B. WEMLINGER, E. PEDROW, P. BARBOSA, G. Acesso em: 13 de fevereiro de 2017. A. HARTMANN, E. AGURELL, C. BEEVERS, A. org/10. s00204-013-1070-0.

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